La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por sus siglas en inglés es una técnica sensible, eficiente y rápida. Se considera toda una revolución en el campo de la medicina, la biología, e incluso la arqueología. Ha sido descrita por The New York Times como «altamente original y significativa, virtualmente dividiendo la biología en dos épocas de antes de P.C.R. y después de P.C.R.»
A su vez, es en la actualidad una técnica muy relevante, siendo el examen más sensible y específico para el diagnóstico del Covid-19. Sin embargo, sus numerosas aplicaciones van mucho más allá del diagnóstico de enfermedades.
¿Qué es?
La PCR es una fascinante técnica de biología molecular. Esta utiliza una poderosa enzima, llamada polimerasa, con el objetivo de hacer millones de copias de una secuencia blanco de ADN, de manera que, podamos detectar y analizar el material genético de una muestra.
La invención de esta espectacular técnica corresponde a los bioquímicos Kary Mullis y Michael Smith, motivo por el cual se les concedió el premio Nobel de química en el año 1993.
No se trata de cualquier polimerasa
Todos los organismos vivos poseen esta vital enzima, que permite sintetizar las moléculas de ADN. Sin ella no se podría realizar la división celular. Las plantas, los animales, nosotros los seres humanos, la poseemos en nuestros núcleos celulares.
Sin embargo, estas polimerasas dejan de funcionar a elevadas temperaturas, necesarias para poder realizar esta técnica. Por lo cual, se necesitaba una polimerasa especial, que no se inactiven al calentarse.
¿Dónde conseguir una polimerasa con esta singular característica? Tenía que provenir de un organismo, adaptado a sobrevivir a altas temperaturas. Se trata de un microorganismo: la bacteria thermus aquaticus.
Esta bacteria, cuyo hábitat son las aguas termales, es capaz de sobrevivir a temperaturas entre 50-80 °C y aún mejor, su polimerasa, la Taq polimerasa, ¡sigue funcionando a temperaturas superiores a 90 °C! Por esta genial propiedad se dice que la Taq polimerasa es una enzima termoestable.
¿Cómo se obtiene esta polimerasa?
Debido a que, la bacteria thermus aquaticus es difícil de mantener y reproducir en el laboratorio, el gen que codifica a la Taq polimerasa se inserta en el núcleo de otra bacteria, la E. Coli, que funciona como una «fábrica» de esta enzima. ¡Impresionante!
Etapas de cada ciclo
La reacción en cadena de la polimerasa se realiza en ciclos. En cada ciclo el número de copias de los fragmentos de ADN aumenta exponencialmente, es decir se «amplifica». Luego de varios ciclos obtendremos millones de copias a partir de unos pocos fragmentos que tenía originalmente la muestra, estas nuevas copias obtenidas se llaman amplicones.
Los elementos que necesitamos para que se lleve a cabo la reacción son: la molécula ADN que queremos copiar que se denomina molde o templado, Los dNTPs (desoxirribonucleótidos trifosfatados: guanina, citosina, timina, adenina) que son los «bloques de construcción» que la polimerasa utiliza para sintetizar ADN, magnesio, una solución amortiguadora y agua.
Cada ciclo consta de estas tres etapas
1. Desnaturalización:
En esta etapa las cadenas de ADN son calentadas. La temperatura es 90 °C durante 20-30 segundos. Esto ocasiona que las cadenas que conforman la doble hélice se separen, cómo cuando se abre una cremallera.
2. Hibridación:
Aquí es donde se utilizan los primers, nuestros geniales marcadores. Estos son secuencias cortas de ADN que se unen a un punto específico de las cadenas de ADN que han sido separadas. De manera que, estos primers marcan el sitio donde debe actuar la polimerasa, es decir le indican a la enzima las partes de la cadena de ADN que debe copiar.
Los primers son muy importantes, ya que la polimerasa no puede sintetizar ADN «de la nada», necesita esas secuencias cortas de nucleótidos como punto de partida. Para que los primers puedan hacer su trabajo correctamente la temperatura de la solución debe descender a 50-60 °C.
3. Extensión:
Aquí actúa la polimerasa, a una gran velocidad. Se une a la cadena que ha sido separada sintetizando ADN complementario a las secuencias que han sido marcadas por los primers, con lo que se generan nuevos amplicones en cada ciclo. La temperatura óptima de trabajo para la polimerasa en esta etapa es de 72 °C
Como vemos, para que pueda producirse cada ciclo es necesario controlar la temperatura y la duración de cada etapa cuidadosamente. El encargado de que cada etapa tenga la temperatura y la duración adecuada es un equipo llamado termociclador.
Este último permite que los ciclos se repitan entre 25 a 40 veces, de manera que las cadenas de ADN se abren al subir la temperatura (90 °C), los primers se unen a ellas cuando la temperatura desciende un poco (50 – 60 °C), y la polimerasa sintetiza la cadena complementaria, generando nuevos amplicones, con los cuales comienza un nuevo ciclo. Al final tendremos millones de copias, a partir de unos pocos fragmentos o moldes.
¿Cómo se analiza el producto de amplificación?
Para ello, se utiliza una técnica llamada electroforesis en gel que nos permite separar a los amplicones que hemos obtenido, de las otras moléculas de la muestra. Para esto, se aplica corriente eléctrica a un gel, que hace que las moléculas se separen, de acuerdo a su carga eléctrica y su peso molecular. Además, se añade Bromuro de etidio (BrEt), una molécula capaz de unirse al ADN y que interacciona con los Rayos Ultravioleta. Lo cual nos permite visualizar el ADN en forma de fluorescentes bandas brillantes cuando se le dirigen los rayos UV.
Se debe conocer con anterioridad el peso molecular de nuestro ADN objetivo, porque al colocar la muestra amplificada en el gel, utilizaremos marcadores de peso molecular, que tengan ese peso específico y nos ayudarán a identificarlas.
Finalmente, la visualización de los amplicones se lleva a cabo tomando una foto digital al gel de agarosa expuesto a luz UV. Veremos como nuestros amplicones «brillan» en forma de bandas; adicionalmente un procesador de imágenes se encarga de analizar las bandas observadas. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa en la que se utiliza la electroforesis en gel, se denomina PCR de punto final.
PCR en tiempo real: cuando ya no es necesaria la electroforesis en gel
Es muy parecida a la PCR de punto final, de la que se ha hablado anteriormente. Sin embargo, la PCR en tiempo real se diferencia en la forma que se analizan los resultados. En esta innovadora técnica, no se utiliza la electroforesis en geles de agarosa. La identificación de los amplicones es en tiempo real, porque se realiza en cada ciclo, a diferencia de la PCR de punto final, donde se realiza después de que se han realizado todos los ciclos.
Para identificar los amplicones en cada ciclo, se utilizan moléculas que emiten una señal fluorescente al unirse al ADN objetivo, un fotodetector captura la señal fluorescente y transmite esa información a un ordenador especializado.
Bibliografía
Tamay DL, Ibarra C, Velasquillo C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Recuperado de: https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf
